二甲雙胍減緩雄性猴子的衰老時鐘（Nrf2通路）
原文來源：Yang Y , Lu X , Liu N ,et al.Metformin decelerates aging clock in male monkeys[J].Cell, 2024, 187(22):6358-6378.e29.DOI:10.1016/j.cell.2024.08.021.
二甲雙胍減緩雄性猴子的衰老時鐘
圖解摘要：長期二甲雙胍治療通過雄性靈長類動物的Nrf2通路降低多維生物年齡并緩解神經元衰老。
亮點：
二甲雙胍可預防老年雄性靈長類動物的腦萎縮，并提升其認知功能；
二甲雙胍能延緩多種雄性靈長類組織的老化進程；
二甲雙胍通過激活Nrf2靶點對雄性靈長類動物的神經元老化起到保護作用。
摘要：在一項歷時40個月的嚴格研究中，我們評估了二甲雙胍對成年雄性食蟹猴的抗衰老保護作用，填補了靈長類動物衰老研究領域的空白。該研究通過全面的生理學、影像學、組織學和分子層面評估，證實了二甲雙胍在生物體水平上延緩年齡相關表型的作用。具體而言，我們運用全組織轉錄組學、DNA甲基化組學、血漿蛋白質組學和代謝組學技術，開發出創新的猴類衰老時鐘模型，并將其應用于評估二甲雙胍的抗衰老效果。研究結果表明，二甲雙胍顯著延緩了衰老指標，其中大腦衰老進程尤為明顯——腦部老化速度約減緩6年。該藥物展現出強大的神經保護作用，既能維持腦結構完整性，又能提升認知能力。其對靈長類神經元的抗衰老效果部分通過激活具有抗氧化功能的轉錄因子Nrf2實現。本研究開創性地通過二甲雙胍系統性降低靈長類動物多維度生物年齡，為開發針對人類衰老的藥物策略開辟了新路徑。
前言
衰老是一個漸進過程，會導致組織功能障礙和生理機能衰退，最終引發神經退行性疾病、心血管疾病及糖尿病等與年齡相關的病癥1-5。值得注意的是，越來越多的證據表明，通過小分子藥物、基因改造、運動鍛煉和飲食干預等手段，嚙齒類動物的衰老特征具有可塑性6-11。作為2型糖尿病的一線治療藥物，二甲雙胍由Galega officinalis的胍衍生物開發而來，，在線蟲、果蠅和嚙齒類等多種模型中展現出延緩生理衰老的潛力12-21。包括本研究在內的前期研究也證實，二甲雙胍能有效緩解人類二倍體細胞的衰老現象21-25。此外，回顧性研究表明該藥物似乎能降低糖尿病患者的死亡率26-28。然而，二甲雙胍能否延緩靈長類動物衰老進程并改善其組織退化仍存在爭議。
借助高通量組學技術這一前沿工具，我們得以在分子層面精準量化生物衰老速率29。通過整合表觀基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學數據的機器學習方法，為“衰老時鐘”研究開辟了新路徑，為評估抗衰老干預措施的有效性提供了科學依據30-36。此外，單細胞測序技術的進步深化了我們對衰老過程復雜細胞與分子機制及其干預手段的理解37。然而，二甲雙胍在全組織層面促進多維度系統性再生的潛力仍有待深入探索。
為探究二甲雙胍是否能延緩與年齡相關的機能衰退，我們開展了一項為期40個月的綜合性研究，評估成年靈長類動物服用二甲雙胍對衰老的影響。研究采用生理檢查、醫學影像、全組織組織學分析、全基因組轉錄組學及單細胞RNA測序（snRNA-seq）等多維度分析技術。通過量化這些參數并整合為“靈長類衰老時鐘”模型，我們發現二甲雙胍可顯著減緩食蟹猴各組織的衰老進程。值得注意的是，研究還揭示了二甲雙胍具有顯著的神經保護作用，這一結論在人類干細胞源性神經元衰老模型中得到進一步驗證。實驗結果表明，長期服用二甲雙胍能有效延緩靈長類衰老，顯示出其在抗衰老管理和疾病預防領域的臨床應用潛力。
結果
長期二甲雙胍治療在靈長類動物中表現出衰老保護作用
為評估二甲雙胍長期治療能否延緩健康靈長類動物衰老，我們開展了一項概念驗證研究。實驗對象為13至16歲的雄性食蟹猴（學名：Macaca fascicularis），相當于人類約40-50歲。研究開始時，按年齡平均分組并隨機分配至二甲雙胍治療組或對照組（下文簡稱O-Met和O-Ctrl）。O-Met組每日給予20毫克/千克二甲雙胍（該劑量與人類糖尿病管理標準一致）38,39，同時保持與O-Ctrl組相同的環境和護理條件（圖1A）。O-Ctrl組中有一只個體在研究第1126天因腎衰竭死亡，經獸醫確認。其余猴子持續接受該方案治療1200天（約3.3年），相當于人類的10年。
兩組受試動物均每3個月進行一次常規體檢（圖1A）。我們觀察到，長期服用二甲雙胍并未導致血糖穩態受損，體重也未出現下降（表S1）。同樣地，我們也沒有發現血細胞組成或尿液生理特征有顯著變化（表S1）。
我們還設置了兩個額外對照組：分別為3-5歲和10-12歲的年輕成年食蟹猴（Y-Ctrl組）及中年成年食蟹猴（M-Ctrl組）。當O-Met組完成1200天二甲雙胍治療后，我們對四組猴子進行了68項生物參數的全面分析。這些指標包括形態學指標（體重指數BMI、器官指數）、血液檢測項目（常規血檢、生化檢測及激素水平），以及影像學指標（計算機斷層掃描[CT]和磁共振成像[MRI]）（圖1B）。綜合分析結果表明，長期使用二甲雙胍具有較高的安全性特征（表S1）。此外，與O-Ctrl組相比，O-Met組的老年相關性牙周骨質流失現象得到顯著改善（圖1C）。
為評估記憶、學習和認知靈活性，我們采用了Wisconsin通用測試裝置（WGTA）方法40,41。在評估記憶保持能力的延遲任務中，O-Met組在延遲后食物提取準確率顯著高于O-Ctrl組，表明二甲雙胍可能增強老年動物的記憶力（圖1D）。此外，在物體辨別任務中，O-Met組展現出更優的學習能力，暗示該藥物對改善老年群體的學習表現具有潛力（圖1D）。同樣，在物體反轉學習任務中，O-Met組相比O-Ctrl組表現出更強的認知適應能力（圖1D）。
在使用MRI研究腦部形態時，廣義線性混合模型（GLMM）顯示老年猴子的皮質厚度較年輕個體有所減少，尤其在額葉和顳葉區域（圖1E和S1A）。與O-Ctrl組相比，接受二甲雙胍治療的老年猴子額葉皮質厚度得以保持，頂葉皮質則呈現增厚趨勢（圖1E和S1A）。組織學檢查結果一致表明，二甲雙胍治療顯著增強了額葉皮質厚度——該區域在猴類中通常會隨年齡增長而變薄（圖1F）。通過使用CHARM5圖譜將大腦劃分為88個區域42，我們發現，在二甲雙胍治療的猴子中，有9個區域（主要在額葉）的皮質厚度有所減少（圖1G和S1B）。這些腦區包括對認知功能至關重要的皮質區域（圖1G和S1B），具體涉及眶額皮層（OFC，即10、11和13號區域）、外側前額葉皮層（LPFC，即9號區域）、前扣帶回皮層（ACC，即24a/b區域）、中扣帶回皮層（MCC，即24a/b初級區域）以及運動皮層（即前SMA和SMA）。其中，眶額皮層和外側前額葉皮層在工作記憶、規則學習和逆向學習中具有重要作用43,44。綜合來看，這些發現結合記憶力和認知功能的改善，表明二甲雙胍可能延緩與衰老相關的腦部結構退化，尤其在額葉區域表現顯著。
二甲雙胍可減輕多個組織中與衰老相關的轉錄波動
為深入解析靈長類衰老機制及二甲雙胍干預的系統性效應，我們開展了全生物體和全基因組范圍的RNA測序分析。研究對象包括三個不同年齡組（Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl）的食蟹猴，以及接受二甲雙胍治療的老年猴（O-Met），共檢測了79個組織器官（涵蓋神經系統、皮膚系統、內分泌系統、消化系統、生殖系統、免疫系統、呼吸系統、心血管系統、肌肉系統、泌尿系統和骨骼系統）（圖2A和S2A）。通過Mfuzz c均值聚類法進行時間序列分析，揭示出四個特征鮮明的轉錄動態集群：集群1呈現持續上調趨勢（U），集群2顯示持續下調趨勢（D），集群3先上調后下調（UD），集群4則呈現早期下調后回升的模式（DU）（圖2B和S2B）。其中，集群U的基因主要與先天免疫應答和炎癥反應相關，而集群D的基因則參與細胞外基質構建和發育過程，這表明隨著年齡增長，組織維護與再生能力逐漸衰退（圖2B）。
接下來，我們研究了二甲雙胍對組織層面年齡依賴性轉錄組變化的影響。通過對比年輕、中年和老年猴（“Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl”）以及年輕、中年猴和二甲雙胍處理的老年猴（“Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Met”）的軌跡變化，發現二甲雙胍干預顯著緩解了四個集群中與年齡相關的整體轉錄動態變化。基因集變異分析（GSVA）顯示，二甲雙胍在U和D集群中顯著挽救了基因表達，對其他兩個集群的影響較弱（圖2C）。為量化二甲雙胍延緩衰老的效果，我們計算了組織特異性“救援評分”（詳見STAR方法）。值得注意的是，二甲雙胍可挽救大部分老化組織（圖2D），在11個系統中的79個組織中，額葉、皮膚、肝臟、腎臟、股四頭肌和肺等組織獲得最高挽救評分（圖2D）。通過GSVA在通路水平分析衰老挽救時，我們發現二甲雙胍治療抑制了與衰老相關的炎癥反應、細胞凋亡、纖維化和活性氧（ROS）通路（圖2E、2F及S2C）。相反，二甲雙胍治療重新激活了通常受衰老抑制的發育和形態發生相關通路，包括Wnt信號傳導、脂質代謝和DNA修復通路（圖2E和2F）。總之，我們的綜合圖譜捕捉了組織轉錄圖譜，揭示了二甲雙胍在靈長類動物中發揮的整體性衰老保護作用。
二甲雙胍可降低各組織中的多種衰老特征
為驗證研究結果，我們進行了全面的組織學評估，重點關注衰老的經典特征，特別是那些具有較高恢復評分的組織。初步觀察顯示，二甲雙胍治療可減少衰老細胞聚集——以肺、肝、腎（包括皮質和髓質）、心臟、胃及皮膚等組織中的p21陽性細胞數量為指標，O-Met組相較于O-Ctrl組呈現顯著下降趨勢（圖3A）。此外，與O-Ctrl組相比，二甲雙胍治療還能有效抑制肺、腎和心臟中與衰老相關的纖維化區域擴張（圖3B）。同樣，以4-羥基壬烯醛（4-HNE）為標志的泌尿系統中與衰老相關的脂質過氧化積累通過二甲雙胍治療得到緩解（圖S3A）。此外，在O-Met猴組織中，二甲雙胍對改善與衰老相關的表觀遺傳不穩定性指標表現出顯著效果，例如H3K9me3的缺失和內源性逆轉錄病毒（ERV）蛋白表達水平的上調（圖S3B和S3C）。更值得關注的是，作為骨骼肌衰老關鍵指標的快肌纖維減少現象，經二甲雙胍治療后得到了有效逆轉（圖S3D）。
值得注意的是，我們發現二甲雙胍在抑制慢性炎癥方面具有廣泛而顯著的作用7,9,45,46。作為衰老的核心標志，慢性炎癥是幾乎所有與衰老相關疾病的根源。補充二甲雙胍可減少肝臟和胃部與衰老相關的炎癥區域，并降低肺、肝、腎等器官中的免疫細胞浸潤（圖3C和3D）。研究還發現，在檢測的多種組織中，二甲雙胍治療能有效抑制衰老相關分泌表型（SASP）因子的異常升高，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、S100鈣結合蛋白A8（S100A8）以及基質金屬蛋白酶9（MMP9）（圖3E-3G和S3E）。綜上所述，我們的研究結果表明，二甲雙胍能有效抑制靈長類動物衰老特征的出現，包括組織退化和炎癥反應。
二甲雙胍降低多組學生物年齡
為量化二甲雙胍誘導的生物年齡減緩效應，我們基于多組學數據建立了猴類衰老時鐘的計算模型。除全組織轉錄組譜分析外，我們還獲取了DNA甲基化譜數據，構建了具有最高轉錄恢復評分的組織DNA甲基化時鐘模型。此外，我們通過質譜技術生成定量血漿蛋白質組數據集和代謝組特征（圖S4A-S4E）。整合Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl隊列（共36只猴子）的數據后，我們成功建立了一個懲罰性線性模型（見STAR方法部分）。該模型可估算每只猴子的生物年齡，并計算ΔAge——即預測生物年齡與該猴子實際生理年齡測量值之間的差異32,47。其中，O-Met組與O-Ctrl組的ΔAge差異被量化為ΔAgeDiff（具體方法參見STAR方法部分）。為此，我們采用彈性網絡方法量化了各生物年齡指標：包括基于DNA甲基化的DNAmAge、基于轉錄組的transcriptAge、基于蛋白質組的proteinAge以及基于代謝組的metabAge，對每只猴子進行評估（圖4A；表S3）。
該分析表明，二甲雙胍治療可使實驗猴的蛋白質年齡平均恢復6.41年（圖4B）。在轉錄組衰老恢復顯著的組織中，DNAmAge也得到了恢復，包括額葉、肺、腎（皮質）、肝和皮膚，它們的平均恢復時間分別為-6.10年、-5.11年、-4.90年、-3.95年和-2.65年（圖4C）。基于這些數據，我們進一步研究了二甲雙胍對各組織轉錄組水平生物年齡的影響。分析結果顯示，所有十三個組織的轉錄年齡均被恢復至更年輕狀態，具體包括跟腱（ΔAgeDiff -5.31年）、肝臟（ΔAgeDiff -4.14年）、支氣管（ΔAgeDiff -3.71年）、肌肉（ΔAgeDiff -3.56年）和肺部（ΔAgeDiff-3.40年）（圖4D及表S3）。綜合來看，通過生物年齡測量結果可以證實，二甲雙胍干預能延緩不同組織和組學層面的衰老進程。
二甲雙胍延緩老年猴子肝臟衰老，增強肝保護作用
作為代謝器官，肝臟表現出二甲雙胍相關的DNAmAge（ΔAgeDiff約為-3.95年）和transcriptAge（ΔAgeDiff約為-4.14年）的顯著降低（圖4C和4D）。為了更精確地分析二甲雙胍的干預效應，我們對Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met組的肝臟樣本進行了snRNA-seq（圖5A和S5A-S5C）。
隨后，我們開發了名為sn-transcriptAge的“單核轉錄組衰老時鐘”，利用覆蓋從年輕到中年再到老年階段的snRNA測序數據，從細胞類型層面表征衰老過程及其減緩機制48。首先，我們通過比較Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl隊列中任意兩組的差異表達基因（DEGs），截斷值為|log2（fold change）| > 0.25，調整后的p值< 0.05，我們將其指定為年齡依賴性DEGs（表S4）。我們以這些衰老差異表達基因的表達矩陣作為輸入數據，以每只猴子的實際年齡作為訓練標簽，采用彈性網絡模型構建單細胞衰老時鐘。通過留一法交叉驗證技術優化模型預測精度（詳見STAR方法部分）。將所有細胞類型數據整合為單一輸入矩陣后，開發出的綜合模型預測二甲雙胍治療可使肝臟平均恢復4.28年（圖5B）。值得注意的是，肝細胞、庫普弗細胞和T細胞這三種特定細胞類型展現出顯著的年輕化修復效果，其sn-transcriptAge指標分別顯示出5.83、6.66和6.43年的平均回歸值（圖5B）。
二甲雙胍治療顯著恢復了O-Ctrl組相較于Y-Ctrl和M-Ctrl組持續上調（U簇）或下調（D簇）的基因表達（圖S5D和S5E）。總體而言，該藥物挽救了約33.9%的U簇差異表達基因和21.2%的D簇差異表達基因（圖S5F）。具體而言，不同細胞類型表現出不同的挽救效果，且存在輕微促衰老作用（圖S5G）。基因功能注釋顯示，D簇基因主要參與肝細胞的關鍵代謝功能，包括脂質轉運（如ABCA9、HACL1和SLC22A7）、脂質分解代謝（如HACL1、CYP4F12和PNPLA3），以及氨基酸分解代謝（如ARG1、GNMT和SHMT1）（圖S5D）。這些結果表明，二甲雙胍治療可緩解衰老引起的肝臟代謝損傷。相比之下，U簇基因在免疫應答（如LBP、C4BPA和C4BPB）、轉化生長因子-β（TGF-β）通路（如SMAD3、TGFBR1和TGFBR3）以及多種細胞類型的炎癥反應中富集（圖S5D）49,50。值得注意的是，在O-Met猴中抑制U簇基因與炎癥和纖維化狀態的減輕相關（圖S5H）。
在對恢復的差異表達基因（DEGs）比例進行排序時，我們結合Augur評分（一種評估各細胞類型對特定處理敏感性的指標）發現，庫普弗細胞、肝細胞和T細胞位列前三，這與我們的生物年齡估算結果一致（圖S6A和S6B）。此外，與衰老相關且恢復最顯著的批量RNA測序DEGs主要歸因于肝細胞的轉錄變化（圖S6C），突顯了其在衰老過程及其通過二甲雙胍治療緩解中的關鍵作用。基因表達軌跡分析顯示，二甲雙胍治療后，肝細胞特異性簇U和D基因的表達顯著恢復至年輕狀態（圖S6D）。具體而言，在O-Met組中，與肝細胞衰老相關的通路（如炎癥反應信號CRP、LBP和絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINA3，以及脂質代謝相關通路ABCB11、HACL1和SCP2）51-55均恢復到類似Y-Ctrl而非O-Ctrl的狀態（圖S6E和S6F）。與生物信息學分析結果一致，組織學檢測證實載脂蛋白E（APOE）——這種最近被確認為衰老生物標志物的脂蛋白成分56,57——的表達上調已恢復至年輕水平（圖S6G和S6H）。通過油紅O染色法，我們驗證了O-Met組中與年齡相關的異常脂滴聚集現象得到緩解（圖S6H）。此外，二甲雙胍可降低肝臟中隨年齡增長而升高的TNF-α水平和纖維化程度（圖S6I和S6J）。綜合來看，這些結果表明二甲雙胍可能通過增強肝細胞代謝功能來保護肝功能。
二甲雙胍延緩大腦衰老，為老年猴子提供神經保護
鑒于二甲雙胍治療后觀察到的腦結構和功能改善，且在DNAmAge分析中額葉顯示出最顯著的修復效果（圖4C），我們下一步重點探究了二甲雙胍對額葉的抗衰老保護作用。采用與肝臟研究相同的方法，我們對四個猴組的額葉樣本進行了snRNA測序（圖5C和S7A）。如同在肝臟snRNA測序分析中所做的那樣，我們訓練了彈性網絡模型來全面評估額葉的轉錄組特征（圖5D和5E）。有趣的是，我們發現經二甲雙胍處理后的大多數細胞類型都恢復到了更年輕的階段，其sn-transcriptAge顯著降低。通過將所有細胞類型的數據整合到一個統一的模型中，我們能夠確定二甲雙胍治療將猴子的額葉平均挽救了5.90年（圖5D）。隨后，抑制性神經元（InN）（ΔAgeDiff-5.59年）、興奮性神經元（ExN）（ΔAgeDiff-5.45年）、小膠質細胞（ΔAgeDiff-6.86年）、少突膠質細胞（OL）（ΔAgeDiff-6.79年）、星形膠質細胞（ΔAgeDiff-6.08年）以及少突膠質細胞前體細胞（OPC）（ΔAgeDiff-5.70年）的sn-transcriptAge均呈現顯著改善（圖5E）。
二甲雙胍治療顯著緩解了所有四個集群（U、D、UD和DU）及細胞類型的基因抑制現象，這與生物年齡的逆轉效果一致（圖S7D和S7E）。在O-Met猴中，對隨年齡增長持續增加的U集群衰老差異表達基因（DEGs）進行分析后，其恢復率達30.1%；而D集群隨年齡下降的基因則恢復了28.0%（圖S7F）。基因本體論（GO術語）分析顯示，神經元功能關鍵基因（如樹突形態發生/延伸和突觸組裝相關基因，例如GSK3B、GRID2和NRG3）在ExN、InN、OL、OPC、小膠質細胞和星形膠質細胞中隨年齡增長而下調，但經二甲雙胍治療后得以恢復（圖5F）。相比之下，免疫反應激活、補體激活和TGF-β受體信號通路調控等隨年齡上調的通路，在二甲雙胍治療下被重新調整至較低水平（圖5F）。我們還通過snRNA測序發現，所有細胞類型中促衰老DEGs的數量極少，表明該劑量下的促衰老效應可能可控（圖S7G和S7H）。實驗驗證表明，二甲雙胍治療使與腦衰老及神經退行性疾病進展相關的標志物恢復至接近年輕猴體內的水平。這包括SAb-gal陽性細胞減少、p-Tau（T181）的積累以及促炎因子如MMP9的減少（圖5G）。此外，我們觀察到，老年猴子特征性的髓鞘厚度減少，在二甲雙胍治療后被重建為年輕狀態（圖5G）。
接下來，Augur評分評估顯示ExN表現出最顯著的二甲雙胍誘導衰老保護效應（圖6A）。鑒于ExN在認知功能中的關鍵作用，我們對額葉ExN進行了深入分析（圖6A-6C）。基因集富集分析（GSEA）表明，二甲雙胍治療恢復了通常隨年齡增長而下調的通路，如突觸膜粘附、樹突形態發生和神經發生（圖6B0。此外，與神經元保護相關的基因——這些基因通常隨年齡增長而被抑制——在二甲雙胍治療下上調。相反，與神經元衰老和凋亡相關的基因則被二甲雙胍下調（圖6C）。這些結果進一步得到一系列組織學檢測的支持，為二甲雙胍的神經保護作用提供了有力證據。具體而言，二甲雙胍治療降低了SPiDER-β-gal陽性神經元的比例，并減輕了核膜完整性受損（圖6D和6E）。此外，該藥物通過減少聚集斑塊和淀粉樣蛋白β（Ab）斑塊，緩解了神經元內異常蛋白質積累（圖6F）。二甲雙胍還增強了神經元再生和突觸連接，表現為樹突伸長——這是神經元結構可塑性和功能能力的關鍵特征（圖6G）。此外，在特別容易受衰老影響的海馬體區域，我們觀察到小膠質細胞（這種細胞與多種神經退行性疾病及衰老過程密切相關）的聚集現象有所減少，同時神經元核膜完整性也得到恢復（圖6H）。值得注意的是，二甲雙胍還能增強海馬區神經前體細胞的活性（圖6H）。這些結果共同表明，通過對抗與年齡相關的細胞變化，二甲雙胍能為神經系統提供全面的保護機制，有效抵御衰老帶來的負面影響。
二甲雙胍以Nrf2依賴的方式自主緩解神經元衰老
我們利用基于人類胚胎干細胞（hESC）衍生神經元的體外模型，評估了二甲雙胍的潛在抗衰老保護作用（圖S8A-S8C）58,59。通過持續15天給予低劑量二甲雙胍（5 mM），我們觀察到神經元衰老指標顯著改善：β-半乳糖苷酶活性降低、聚集體和淀粉樣蛋白沉積減少、白細胞介素-6（IL-6）表達下調，同時核纖層蛋白B2水平恢復（圖7A-7C及S8D-S8F）。這些結果表明，二甲雙胍可能通過細胞自主機制延緩人類神經元衰老進程。
在評估二甲雙胍潛在下游效應因子的蛋白水平時，我們觀察到二甲雙胍治療恢復了核因子紅系源性2樣2（磷酸化Nrf2）的活性形式，這是一種關鍵的細胞抗氧化反應調節因子，通常在長時間的神經元培養過程中下降（圖S8G和S8H）。二甲雙胍治療顯著提升了神經元核內磷酸化Nrf2水平，同時上調了HO-1、NQO-1、SOD3、GPX2和GPX1等Nrf2靶基因的表達。這些基因在人類神經元（hNeuron）衰老過程中通常處于抑制狀態并呈現下調趨勢（圖7D、7E、S8I和S8J）。值得注意的是，二甲雙胍處理降低了脂質過氧化產物4-HNE的表達及活性氧水平，表明與對照組相比，O-Met組的氧化應激水平明顯降低（圖7F和S8K）。此外，二甲雙胍誘導的hNeuron部分基因表達變化在體內實驗中也得到部分驗證（圖S8L）。經二甲雙胍處理后，衰老hNeuron的線粒體基因表達或mtDNA含量未出現顯著改變（圖S8M-S8P）。這些結果提示，Nrf2活性的增強可能是二甲雙胍在靈長類動物神經元中發揮抗衰老保護作用的關鍵機制。
為驗證假設，我們采用兩種方法調控hNeuron中的Nrf2活性。首先，通過小干擾RNA（siRNA）敲低Nrf2（圖7G、S9A和S9B），即使在二甲雙胍存在的情況下，仍能顯著降低活性Nrf2及其靶基因的核內水平（圖7H、7J、S9C和S9D）。抑制Nrf2會加速神經元衰老進程，而二甲雙胍治療對此無效（圖7I和7J）。這些結果表明，二甲雙胍的神經保護作用至少部分依賴于Nrf2活性。其次，我們構建了攜帶E82G突變型Nrf2的人神經元模型，該突變通過阻斷KEAP1結合增強Nrf2激活（圖7K、S9E和S9F）60,61。這種基因增強策略顯著激活了Nrf2通路，表現為核內Nrf2磷酸化水平升高、靶基因表達上調，以及4-HNE和ROS等氧化標志物水平下降——與野生型形成鮮明對比（圖7L、7N和S9G-S9I）。因此，長期培養的hNeuron中觀察到的細胞衰老表型得到逆轉（圖7M和7N）。此外，Nrf2持續激活產生的抗衰老效應超越了單獨使用二甲雙胍的效果，且當與E82G突變共用時，二甲雙胍并未增強這些效果（圖7M和7N）。這些研究結果與核內磷酸化Nrf2的水平高度吻合，表明Nrf2通路的激活是二甲雙胍延緩人類神經元衰老的關鍵機制。與體外實驗結果一致，經二甲雙胍處理的猴子在多個組織中也檢測到Nrf2通路的激活現象，包括額葉神經元（圖7O、7P和S9J）。綜上所述，二甲雙胍通過激活Nrf2通路，顯著延緩了神經元衰老進程，進而延緩大腦衰老。
討論
在三年多的時間里，我們評估了二甲雙胍對健康猴子的全身性衰老保護作用，利用其與人類相似的生理和器官結構，以及它們對疾病和藥物的反應58,62-65。我們的研究結果表明，二甲雙胍能夠改善靈長類動物體內的衰老過程，多維度衰老時鐘在治療后顯示出年輕化的趨勢。鑒于衰老的復雜性66-69，對抗衰老干預措施進行全面評估至關重要32,70,71。我們的研究揭示了二甲雙胍具有組織和細胞特異性的抗衰老保護作用，尤其能顯著提升靈長類動物的認知功能。現有證據表明，即使在5 μM濃度下二甲雙胍仍可穿越血腦屏障72-77，從而發揮神經保護作用。這些發現提示二甲雙胍可能具有延緩大腦衰老的潛力，并有望用于治療神經退行性疾病及其他慢性病癥78-80。
除了糖尿病管理作用外，我們的研究還表明二甲雙胍對健康老年猴的血糖影響較小（表S1）。我們證實二甲雙胍通過細胞自主通路延緩神經元衰老和腦部老化，其中Nrf2的內在抗氧化機制起著關鍵作用。與二甲雙胍通過AMP激活的蛋白激酶（AMPK）激活和線粒體電子傳遞抑制而建立的保護機制不同77,82-86，我們的研究結果強調了Nrf2抗氧化途徑是一個有希望的衰老保護靶點22,87-90。
值得注意的是，我們在靈長類動物研究中使用的二甲雙胍劑量處于標準治療范圍內12,14,91-94，這使得我們的研究成果對人類治療具有更強的適用性。觀察到的衰老生物標志物逆轉現象表明，針對器官核心衰老機制進行干預是可行的，為改善慢性疾病和預防與年齡相關的疾病提供了新策略。本研究確定了靈長類動物二甲雙胍的最佳給藥劑量和時機，闡明了器官特異性敏感性，并提供了藥效學見解。此外，我們還引入了用于評估干預效果的預測性生物標志物，包括來自臨床活檢樣本的血漿時鐘和組織時鐘31,95。這些創新性生物標志物為評估抗衰老干預措施建立了臨床標準31,96,97，為系統評估藥物對衰老的影響及制定對抗與年齡相關慢性疾病的策略提供了結構化方法。
圖1.長期二甲雙胍治療對食蟹猴的行為與影像學評估
(A)食蟹猴長期二甲雙胍治療分析流程示意圖。本研究圖表中的圖形元素源自BioRender.com和Flaticon.com。(B)食蟹猴形態測量分析、醫學影像分析及血液分析示意圖。(C)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met組食蟹猴牙槽骨微CT檢查結果。量化數據以均值±標準誤表示，單因素方差分析p值已標注。Y-Ctrl組n = 6；M-Ctrl組n = 3；O-Ctrl組n = 5；O-Met組n = 6。(D)采用威斯康星通用測試裝置（WGTA）評估O-Ctrl和O-Met組食蟹猴在延遲任務（上）、辨別任務（中）及反轉任務（下）的表現。數據以中位數±標準誤呈現。延遲與辨別任務的ANOVA p值已標注，反轉任務的曼-惠特尼U檢驗p值亦一并標注。受試者數量為O-Ctrl組n = 5，O-Met組n = 6。(E)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met組食蟹猴額葉皮質厚度的磁共振成像（MRI）評估結果。以對數2倍變化值表示與O-Ctrl組相比的皮質厚度變化，每個個體猴的皮質厚度數據分別采集自左右半球。各猴子雙側皮層厚度數據以平均值形式呈現。受試者數量統計：Y-Ctrl組6只，M-Ctrl組3只，O-Ctrl組8只，O-Met組6只。數據以中位數±標準誤表示，并標注GLMM分析的p值。(F)圖示Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl及O-Met猴額葉NeuN蛋白免疫組化評估結果。比例尺為100毫米。Y-Ctrl組6只；M-Ctrl組3只；O-Ctrl組5只；O-Met組6只。量化數據以均值±標準誤表示，采用單因素方差分析并附Tukey多重比較檢驗p值。(G)通過MRI掃描觀察Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl及O-Met猴88個腦區。可視化重點顯示二甲雙胍誘導年輕化治療后皮層厚度顯著變化（p < 0.05）的腦區。受試者數量統計：Y-Ctrl組6只；M-Ctrl組3只；O-Ctrl組8只；O-Met組6只。餅圖展示二甲雙胍誘導年輕化治療后各腦葉區域比例分布。詳見附圖S1及表S1。
圖2. 二甲雙胍逆轉了猴體內多種組織的年齡相關基因表達
(A)示意圖展示了11個系統中的79種組織在轉錄組分析中的變化。(1)皮膚（頭皮）；(2)皮膚（前腹側）；(3)皮膚（后腹側）；(4)皮膚（內側腹側）；(5)皮下脂肪（面部）；(6)皮膚（背側腹側）；(7)皮膚（中腹側）；(8)大腦（枕葉）；(9)大腦（顳葉）；（10）大腦（頂葉）；（11）大腦（枕葉）；（12）大腦（枕葉）；（13）腦干；（14）小腦；（15）大腦（額葉）；（16）大腦（額葉）；（17）大腦（海馬體）；（18）背根神經節；（19）脊髓；（20）正中神經（上行）；（21）坐骨神經（下行）；（22）牙齦；（23）舌頭；（24）食道；（25）胃；（26）肝臟（右葉）；（27）肝臟（中葉）；（28）肝臟（左葉）；（29）脂肪組織（胰腺）；（30）胰腺；（31）腸道（十二指腸）；（32）腸道（空腸）；（33）腸道（回腸）；（34）脂肪組織（膈肌）；（35）腸道（胸廓）；（36）甲狀腺；（37）腎上腺；（38）腎臟（髓質）；（39）腎臟（皮質）；（40）膀胱；（41）外周血單個核細胞（PBMC）；（42）脾臟；（43）精囊；（44）前列腺；（45）陰莖；（46）附睪；（47）睪丸；（48）肌肉（背部）；（49）岡上肌腱；（50）肌肉（肱二頭肌）；（51）肌肉（腓腸肌）；（52）跟腱；（53）肌肉（斜方肌）；（54）肌肉（腹部）；（55）肌肉（臀部）；（56）肌肉（股四頭肌）；（57）黃韌帶；（58）腰椎間盤；（59）心臟（右心房）；（60）心臟（左心房）；（61）心臟（右心室）；（62）主動脈（弓部）；（63）主動脈（胸段）；（64）膈肌；（65）肺（右肺）；（66）肺（左肺）；（67）肺（右肺）；（68）肺（左肺）；（69）氣管（上段）；（70）氣管（下段）；（71）支氣管（上段）（72）支氣管（下部）；（73）皮膚（手部）；（74）肺泡組織（頸部）；（75）皮膚（頸部）；（76）肩胛骨肺泡組織；（77）皮膚（背部）；（78）腹腔肺泡組織；（79）皮膚（腹部）。各組織全稱詳見表S1。(B)猴類組織轉錄組數據聚類分析，圖中顯示各簇中年齡相關基因的計數。實線和色帶表示各簇標準化FPKM值的平均值±標準差。(C)左圖：二甲雙胍治療后猴類年齡相關基因表達變化。實線和色帶表示各簇標準化FPKM值的平均值±標準差。右圖：箱線圖展示不同組別中年齡相關基因的GSVA評分，標注Wilcoxon秩和檢驗p值。(D)點圖展示二甲雙胍治療后各老年組織的恢復評分。初始階段，使用GSVA算法量化不同組別猴類器官中持續上調和下調的老化基因（簇U和D）的表達量。(E)熱圖顯示基于GSVA評分與衰老相關的恢復通路。(F)箱線圖對比特定組織中的選定恢復通路，標注limma軟件計算的適度t檢驗p值。另見圖S2和表S2。
圖3.二甲雙胍緩解猴類組織的多種衰老特征
(A)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、肝、腎、心、胃及皮膚中p21的免疫組化評估。箭頭指示p21陽性細胞。肺、肝、腎、心、胃標尺為20毫米；皮膚標尺為10毫米。(B)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、腎、心的馬松三色染色評估。標尺為20毫米。(C)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、肝、腎CD45的免疫組化與免疫熒光檢測。箭頭指示CD45陽性細胞。標尺為20毫米。(D)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肝、胃蘇木精-伊紅（H&E）染色評估。虛線圓圈和箭頭指示炎癥區域。標尺為40毫米。(E)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、腸TNF-a的免疫組化與免疫熒光檢測。箭頭指示TNF-a陽性細胞。標尺為20毫米。(F)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腸IL-1b免疫熒光檢測。箭頭指示IL-1b陽性細胞。標尺為20毫米。(G)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、心、肝、腎S100A8的免疫組化與免疫熒光檢測。箭頭指示S100A8陽性細胞。標尺為20毫米。圖(A)-(G)中的定量數據以均值±標準誤表示，其中(C)圖肝臟數據采用Mann-Whitney檢驗p值，(A)(B)圖通過單因素方差分析結合Tukey多重比較檢驗得出p值，(C)及(D)-(G)圖分別對應肺部和腎臟數據。Y-Ctrl組樣本量n = 6；M-Ctrl組n = 3；O-Ctrl組n=4-5；O-Met組n=5-6（數據來源見(A)-(G)圖）。詳見附圖S3。
圖4.二甲雙胍治療猴類生物衰老的多組學分析
(A)二甲雙胍治療猴類多層次生物年齡評估示意圖。(B)左圖：基于血漿蛋白質組學預測的生物年齡（蛋白年齡）散點圖；右圖：二甲雙胍對猴類蛋白年齡的恢復效果箱線圖。(C)棒狀圖展示基于DNA甲基化數據的猴類多組織生物年齡（DNA甲基化年齡，DNAmAge）；中圖：基于組織DNA甲基化數據的顯著（p < 0.05）二甲雙胍誘導組織DNAmAge恢復散點圖；下圖：二甲雙胍治療對猴類DNAmAge恢復效果的箱線圖。(D)棒狀圖展示基于批量RNA測序數據的猴類多組織生物年齡（轉錄本年齡，transcriptAge）；中圖：基于組織批量RNA測序數據的前5個二甲雙胍誘導組織恢復散點圖；下圖：二甲雙胍治療后猴類轉錄本年齡下降箱線圖。圖中(C)和(D)所示恢復組織均置于水平線上方，組織點顏色與圖2A一致。圖B-D中的虛線表示預測生物年齡與猴類實際年齡預期值（DAge = 0）無差異，點距虛線距離代表個體衰老速度。圖(B)至(D)中的Wilcoxon秩和檢驗p值已標注。另請參見圖S4和表S3。
圖5.二甲雙胍緩解猴類肝臟及額葉衰老(A) UMAP圖展示猴類不同肝細胞類型的分布（上）。其他UMAP圖顯示4組間細胞類型分布（下）。(B)徑向柱狀圖展示二甲雙胍通過肝snRNA測序數據恢復多種猴肝細胞類型生物年齡（sn-transcriptAge）的效果。散點圖呈現肝snRNA測序的sn-transcriptAge數據。箱線圖顯示二甲雙胍對猴sn-transcriptAge的恢復效果。僅繪制顯著性（Wilcoxon秩和檢驗p值< 0.05）的恢復細胞類型，圓點代表測試集或O-Met組中的元細胞。(C) UMAP圖顯示腦部（FL）不同細胞類型的分布（左）。UMAP圖顯示4組間不同細胞類型的分布（右）。(D)散點圖展示額葉snRNA測序預測的整合生物年齡（sn-transcriptAge）（左）。箱線圖顯示二甲雙胍治療對猴額葉整合生物年齡的恢復效果。每個圓點代表測試集或O-Met組的元細胞。(E)徑向柱狀圖展示基于額葉snRNA測序的猴額葉多細胞類型生物年齡（sn-transcriptAge）恢復效果（左）。散點圖（右上）顯示來自額葉snRNA測序的sn-transcriptAge數據。箱線圖（右下）展示二甲雙胍治療對猴sn-transcriptAge的恢復效果。通過Wilcoxon秩和檢驗篩選出的具有統計學意義（p<0.05）的救援細胞類型均被單獨繪制。左圖中的點狀圖展示了額葉snRNA測序數據的整合sn轉錄年齡。箱線圖顯示了二甲雙胍治療對猴類額葉整合生物年齡的改善效果，每個圓點代表測試組或對照組的元細胞。(F)網絡圖展示了通過功能富集分析發現的、在不同細胞類型中上調和下調的差異表達基因顯著富集的代表性GO術語。(G)對Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦衰老的評估包括：SA-b-gal染色、p-Tau（T181）和MMP9免疫熒光檢測，以及額葉平均髓鞘厚度的電子顯微鏡分析。腦部SA-b-gal染色及p-Tau（T181）/MMP9免疫熒光分析的比例尺為20毫米；電子顯微鏡分析平均髓鞘厚度的比例尺為1毫米。Y-Ctrl組n = 6；M-Ctrl組n = 3；O-Ctrl組n = 5；O-Met組n = 6。量化數據以均值±標準誤表示，單因素方差分析結合Tukey多重比較檢驗的p值已標注。(B)、(D)、(E)圖中的虛線表示預測生物年齡與實際年齡預期測量值（DAge = 0）無差異，圓點與虛線間距代表個體衰老速率。另見附圖S5、S6、S7及表S4。
圖6.二甲雙胍在老年猴額葉中展現神經保護特性
(A)Augur軟件通過snRNA測序繪制的細胞類型優先級散點圖。(B)顯示年齡依賴性差異表達基因的散點圖。排序依據log2倍數變化（左圖：O-Met/O-Ctrl）。紅色、藍色和灰色圓點分別代表上調、下調及未恢復的基因。右側柱狀圖展示二甲雙胍治療后猴額葉興奮性神經元的基因集富集分析（GSEA）結果。(C)四組代表性基因集評分的嶺圖，黑色線表示中位表達量，標注Wilcoxon秩和檢驗p值。(D)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦額葉SPiDER-b-gal染色評估及NeuN免疫熒光檢測。比例尺：20毫米。(E)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦額葉Lamin B2與NeuN免疫熒光檢測。比例尺：20毫米。(F)攻擊小體評估（上）及Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦額葉Ab（4G8）免疫熒光檢測（下）。比例尺：20毫米。(G)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦額葉高爾基體染色分析。比例尺：20毫米。(H)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦海馬區IBA-1、DCX和LAP2免疫熒光檢測。比例尺：20毫米。圖(D)-(H)中的定量數據以均值±標準誤表示，采用單因素方差分析結合Tukey多重比較檢驗。圖(D)-(G)中顯示了IBA-1和LAP2的p值，圖(H)中顯示了DCX的Mann-Whitney檢驗p值。Y-Ctrl組樣本量n=5-6；M-Ctrl組樣本量n = 3；O-Ctrl組樣本量n = 5；O-Met組樣本量n=5-6（見圖(D)-(H)）。另請參閱圖S7和表S4。
圖7.二甲雙胍通過依賴Nrf2的機制延緩神經元衰老
(A) 體外培養hNeuron的二甲雙胍抗衰老作用示意圖，詳細說明了所采用的處理方案。Veh為溶劑對照；Met為二甲雙胍。
(B) Veh或Met處理35天后hNeuron的SA-β-gal染色評估。比例尺：20μm。
(C) Veh或Met處理35天后MAP2標記hNeuron中抗體（4G8）的免疫熒光分析。箭頭指示4G8陽性神經元。比例尺：20μm和5μm（放大圖像）。
(D) Veh或Met處理35天后hNeuron中p-Nrf2水平的Western blot分析。
(E) Veh或Met處理35天后MAP2標記hNeuron中p-Nrf2的免疫熒光檢測。比例尺：20μm和5μm米（放大圖像）。
(F) Veh或Met處理35天后MAP2標記hNeuron中4-HNE的免疫熒光分析。比例尺：20μm和5μm（放大圖像）。
(G) si-NC或si-Nrf2 hNeuron在擴展培養中的二甲雙胍治療示意圖，標注了具體處理方案。(H)Veh或Met處理21天后MAP2陽性si-NC或si-Nrf2 hNeuron中p-Nrf2的免疫熒光分析。比例尺：20μm。
(H) Veh或Met處理21天后si-NC或si-Nrf2 hNeuron中SA-b-gal染色評估。比例尺為20μm。
(J)定量分析經Veh或Met處理后第21天si-NC或si-Nrf2 hNeuron中p-Nrf2的平均熒光強度及SA-β-gal陽性細胞比例。
(K)野生型（WT）或Nrf2 E82G hNeuron在擴展培養中接受二甲雙胍治療的示意圖，如圖所示。
(L)經Veh或Met處理后第35天MAP2標記的WT或Nrf2 E82G hNeuron中p-Nrf2的免疫熒光檢測。比例尺為20μm。
(M)經Veh或Met處理后第35天WT或Nrf2 E82G hNeuron中SA-β-gal染色評估。比例尺為20μm。
(N)經Veh或Met處理后第35天WT或Nrf2 E82G hNeuron中p-Nrf2的平均熒光強度及SA-b-gal陽性細胞比例的定量分析。
(O)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦（FL）中p-Nrf2與NeuN的免疫熒光檢測。比例尺為20μm。
(P)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴腦（FL）中4-HNE和NeuN的免疫熒光分析。比例尺為20μm。
圖(B)-(F)、(J)和(N)-(P)中的量化數據以均值±標準誤表示，(B)-(F)采用雙尾Student‘s t檢驗p值，(J)和(N)-(P)采用單因素方差分析結合Tukey多重比較檢驗p值。各組n = 3個生物學樣本：(B)-(F)、(J)和(N)；Y-Ctrl組n = 6；M-Ctrl組n = 3；O-Ctrl組n = 5；O-Met組n=6（見(O)和(P)）。
專題薈萃：本文由福山生物整理翻譯，轉載請注明出處。