蘿卜硫素及其他異硫氰酸酯對幽門螺桿菌尿素酶的抑制作用研究
原文來源：Fahey J W , Stephenson K K , Wade K L ,et al.Urease from Helicobacter pylori is inactivated by sulforaphane and other isothiocyanates[J].Biochemical & Biophysical Research Communications, 2013, 435(1):1-7.DOI:10.1016/j.bbrc.2013.03.126.
蘿卜硫素及其他異硫氰酸酯對幽門螺桿菌尿素酶的抑制作用研究
摘要
幽門螺桿菌感染已很普遍，其可引起十二指腸炎癥、潰瘍，并增加胃癌的風險。源自可食用十字花科植物，如西蘭花中的異硫氰酸酯（ITC）蘿卜硫素（SF，1-異硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷）對幽門螺桿菌及其耐藥性菌種均具有顯著的殺菌作用，表明異硫氰酸酯可能是一種有效的食療方法。幽門螺桿菌感染，具有很高的尿素酶活性，可產生氨，中和胃酸并促進炎癥。 SF抑制（滅活）幽門螺桿菌和jack bean菌的尿素酶，這一研究結果的發現，提出了這些特性是否可能在功能上相關的問題。尿素酶活性的失活速率，取決于酶和SF的濃度，并表現出一級動力學特征。純化的幽門螺桿菌尿素酶經過SF處理后，其在280-340 nm波長處的紫外線吸收會發生變化，且隨處理的時間的增長而增加。這一直接的光譜學證據表明，在異硫氰酸酯SF和尿素酶的半胱氨酸硫醇之間形成了二硫代氨基甲酸酯。SF使幽門螺桿菌尿素酶失活的能力令人驚喜。與SF具有相近結構的的天然異硫氰酸酯（berteroin, hirsutin, phenethyl isothiocyanate, alyssin, erucin），雖然它們都有殺菌活性，但并沒有使尿素酶失活的作用。此外，SF對尿素酶陽性和陰性的幽門螺桿菌都具有殺菌作用。相反，某些異硫氰酸酯（例如苯甲?；?異硫氰酸酯）是非常有效的尿素酶滅活劑，但沒有殺菌作用。因此，SF和其他異硫氰酸酯對幽門螺桿菌的殺菌作用與尿素酶失活沒有必然聯系，但它們可以減少幽門螺桿菌感染的炎癥成分。
關鍵詞：洋刀豆尿素酶；芥子油苷；二硫代氨基甲酸酯
1. 前言
幽門螺桿菌感染已很普遍，困擾著超過一半的人口，并顯著增加了患消化性潰瘍，胃惡性腫瘤和淋巴瘤的風險。幽門螺桿菌在不利于其生長胃酸性環境中的成長能力，取決于尿素酶（尿素氨基水解酶； EC 3.5.1.5）的大量產生水平（占總蛋白質的10-15％）。盡管尿素酶在自然界中分布廣泛，但這種酶并不存在于哺乳動物組織中。通過從宿主尿素中產生氨，尿素酶可中和胃酸，從而使幽門螺桿菌可以在胃液中增殖。從未從患者中分離到尿素酶缺陷的幽門螺桿菌突變株。值得注意的是，尿素酶可促進粘膜炎癥，也可促進其他幾種重要的人類致病性感染：結核分枝桿菌，新型隱球菌（與肺部感染有關）和變形桿菌（與尿路感染有關）。
十年前，我們做出了完全出乎意料的實驗結果，蘿卜硫素[SF; CH3S(O)(CH2)4NCS]是一種異硫氰酸酯，其衍生自同源的芥子油苷（硫代葡萄糖苷），其在西蘭花和其他可食用的十字花科植物中含量很高，對幽門螺桿菌具有非常強的殺菌作用。 此外，SF對大量幽門螺桿菌臨床分離株非常活躍，其中包括許多對常規抗生素如克拉霉素和甲硝唑具有耐藥性的菌株。 這立即提出了一個問題，即飲食上服用SF是否可能是一種在全球范圍內對抗幽門螺桿菌感染的實用且經濟可行的治療方法。 幽門螺桿菌的臨床病例和小鼠試驗顯示，蘿卜硫素對于幽門螺桿菌感染，盡管不能完全治愈，但能明顯減少了定植和炎癥。
盡管尿素酶于1926年從洋刀豆中結晶出來，但其分子結構直到最近才被闡明。 來自植物和細菌的尿素酶分子量非常大（1.1百萬道爾頓），并且是高度同源的分子，包含12個富含硫醇的催化亞基（每個亞基12個半胱氨酸殘基），每個活性位點都有兩個鎳離子（Ni2 +）。 這些半胱氨酸硫醇的反應性以及可逆抑制劑和不可逆滅活劑對它們的修飾作用已得到廣泛研究和報道。許多半胱氨酸殘基易受邁克爾反應受體（例如α，β-不飽和酮）抑制的作用。因此，異硫氰酸酯（例如SF）是尿素酶的有效滅活劑也就不足為奇了。
本文分析了SF和相關異硫氰酸酯對幽門螺桿菌尿素酶的抑制作用機理，以及該過程與SF殺菌活性的關系。 由于SF和其他異硫氰酸酯來源于廣泛食用的十字花科植物，并且已通過口服給藥、臨床試驗研究表明其耐受性良好，因此希望該類化合物可以作為改善幽門螺桿菌感染的全球策略而進一步得到開發利用。
2. 材料與方法
2.1. 材料
洋刀豆（Canavalia ensiformis）尿素酶和其他試劑購自Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）或Fisher Scientific（賓夕法尼亞州匹茲堡）。 活幽門螺桿菌培養物的所有工作均在生物安全2級實驗室中進行。
2.2. 細胞培養
在這項研究中使用了五株幽門螺桿菌。 除SS-1（由麻省理工學院的詹姆斯·?？怂共┦刻峁┮酝獾乃芯昃@自美國典型培養物保藏中心：J99（ATCC 700824），26695（ATCC 700392），60190（ATCC 49503）；美國特有種。 尿素酶陰性變種60190（ATCC 51110），Sydney Strain（SS-1）。 所有幽門螺桿菌培養物均在胰蛋白酶大豆瓊脂（Difco）上補充5％的去纖維蛋白羊血（Hemostat Laboratories，Dixon，CA）和Difco Brucella Broth 5％的胎牛血清（Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA）維持。 在BBL Campy Pack Plus系統（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）的微需氧條件下，將所有幽門螺桿菌培養物保持在37°C下，每盒使用3個除氧小袋，每2-3天更換一次，或在培養箱中 供應10％的二氧化碳。
2.3. 尿素酶活性測試
通過混合25μl/孔的pH 6.8的100 mM磷酸鉀緩沖液（含1-4 I.U），在96孔微量滴定板中制備測定混合物。 尿素酶和25μL/孔的潛在抑制劑，并在25°C下孵育指定的時間。 滅活期后，添加酶分析混合物，其中包含200 mL體積的100 mM磷酸鉀緩沖液，pH 6.8，最高達150 mM尿素和0.002％的酚紅。 在3分鐘內測量570 nm處的吸光度線性變化，并表示為每分鐘的毫吸光度單位（mAU / min）。 對于比活測定，將反應速度通過蛋白質濃度實現標準化測定。
2.4. 幽門螺桿菌尿素酶的分離與純化
尿素酶的提取
用幽門螺桿菌接種一百個10-cm培養皿（見上文），并孵育4天; 將細菌草坪直接刮入pH 7.0的20 mM磷酸鉀緩沖液中，并在-80°C冷凍> 8 h。 將冷蒸餾水（1-4°C）添加到冷凍的細胞沉淀中，渦旋解凍，然后離心（5,600×g）10分鐘。 除去上清液部分，用5mL冷水再次萃取沉淀，并過濾收集的上清液（0.22μm）。 將濾液（總量約35 mL）離心濃縮（100,000 MWCO Centricon）至11 mL，與甘油混合，以13.2 mL的體積終濃度為20％（v / v），并在以0.5毫升等分試樣，-20°C保存。
尿素酶的純化
通過FPLC和陰離子交換色譜柱，進一步純化部分幽門螺桿菌尿素酶。使用酚紅測定法測定組分中的尿素酶活性，使用雙辛可尼酸測定法測量蛋白質含量。合并含有尿素酶活性的組分，通過透析（10,000 MWCO Slide-A-Lyzer cassettes；Thermo Scientific）進行脫鹽和濃縮。最后一組合并的餾分集中在10,000 MWCO Amicon“ Ultracell”（Millipore, Billerica, MA）中。通過在SDS PAGE 12％分離凝膠（BioRad，Hercules，CA）上電泳評估組分的純度。首次FPLC分離使用了Sephacryl S-300 HR 26/60色譜柱（60×2.6 cm，Pharmacia），該凝膠已用凝膠滲透緩沖液平衡過。流速為1 mL / min，洗脫Vo體積后連續收集4-mL餾分。將合并的含尿素酶的組分對離子交換負載的Bis-Tris丙烷緩沖液（120 mM 1,3-雙[三[三（羥甲基）-甲基氨基]丙烷）進行透析，并用鹽酸調節至pH 6.9。將合并的尿素酶餾分在100K MWCO Amicon Centricon設備中濃縮至最小體積。最終純化是在MonoQ HR 5/5陰離子交換柱（5×0.5 cm，Pharmacia）上進行的，該柱用相同的緩沖液平衡（流速1 mL / min，使用線性0 – 500 mM NaCl梯度收集的UV峰 18 mL）。合并含有尿素酶的組分，用凝膠滲透緩沖液透析，并濃縮至500μL。
2.5. 尿素酶光譜研究
測量并記錄將蘿卜硫烷單獨添加到幽門螺桿菌尿素酶中引起的光譜變化的時間過程（0-120分鐘）。 將部分純化的幽門螺桿菌尿素酶（3 mg蛋白/ mL）稀釋到10 mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.2和0.74 mM蘿卜硫烷中（LKT Laboratories，St.Paul，MN）; （最終體積為300微升時為9微克）。 使用一對匹配的石英比色皿（4 mm窗口），使用Varian Cary 1E紫外/可見分光光度計（Varian，Walnut Creek，CA）進行光譜測量。
2.6. 最低殺菌濃度測定(MBC)
幽門螺桿菌菌株在含有5％去纖維蛋白羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上作為原種培養，并在37°C的微需氧條件下（10％CO2）培養3-4天。 最小殺菌濃度（MBC）的測定在96孔微量滴定板中進行，將測試化合物在含5％（v / v）胎牛血清（每孔最終體積100μL）的胰蛋白酶大豆肉湯中連續稀釋。 每個測試孔接種5μL幽門螺桿菌懸浮液，調整至終濃度?107CFU / mL（A600 nm = 0.12）。 將測定板孵育3天，然后將每個處理孔中的樣品在固體培養基上再接種3-4天。 MBC被評定為抑制幽門螺桿菌菌落形成的最低測試化合物濃度。
3. 結果與討論
3.1. 尿素酶活性測定
NH2 - CO - NH2 + H2O → H2N - COOH + NH3 → H2CO3 + 2 NH3
在含有酚紅的弱緩沖（pH 6.8）檢測系統中的96孔微量滴定板中測定了尿素酶活性。 產生的NH3對酚紅（pKa 8.2）的酚羥基進行電離作用，導致570 nm處的吸收增加。 如最初由Van Slyke＆Archibald所描述的，在最初的3分鐘反應期間，這些吸收增加被用作酶活性的測定。 該測定適用于微量滴定板形式。 由于先前尚未證明570 nm處的吸收變化相對于NH3生成和pH呈線性關系，因此我們證實以這種方式確定的反應速度在足夠寬的范圍內與酶數量呈線性相關關系（圖1），以提供簡單的方法 進行這些研究的定量分析。
圖 1微孔滴定標準曲線，通過改變酚紅的吸收率測定氨的含量。 將NH4OH的等分試樣添加到200μL的100 mM磷酸鉀（pH 6.8）中，該磷酸鉀包含0.002％酚紅，并測定570 nm（○）和pH（●）的吸收變化。 插圖顯示了添加越來越多的NaOH后酚紅的吸收光譜以及發色團的結構。
在pH 6.8和25°C條件下，通過使用相對于尿素濃度的線性雙線性倒數作圖，在80 mM磷酸鉀緩沖液中，尿素酶的Michaelis 常數為20 mM，對于jack bean尿素酶為20 mM，部分從幽門螺桿菌中提取純化的尿素酶為4.0 – 6.25 mM。
3.2. 蘿卜硫素滅活尿素酶的藥代動力學
當尿素濃度在20 – 120 mM時，進行尿素酶活性測量時，通過標準測定方法，將蘿卜硫烷或硼酸（一種公認的尿素酶抑制劑）直接添加到幽門螺桿菌尿素酶或jack bean尿素酶中對尿素酶活性沒有影響。相反，在不存在尿素的情況下，將這些酶與抑制劑一起培育會導致酶活性下降。尿素酶活性喪失的速率和程度取決于三個因素：抑制劑的濃度，與抑制劑一起培育的持續時間以及酶的濃度。使用SF作為抑制劑，殘留酶活性完全不受測定系統中尿素濃度（20 – 120 mM）的影響，一旦這些尿素酶失活，通過增加尿素濃度無法恢復活性（如圖2A和2B所示）。在這方面，來自幾種幽門螺桿菌（Hp J99，Hp 26695，Hp SS-1和Hp 60190）和jack bean的尿素酶表現相似（如圖2C所示）。與之形成鮮明對比的是，尿素酶與硼酸的預先孵育以時間和濃度依賴性的方式，降低了尿素酶的活性，但增加測定系統中尿素的濃度，至少可部分逆轉了抑制作用（如圖2D所示）。這種行為與SF對幽門螺桿菌的基本不可逆失活相一致，表明酶和抑制劑之間發生了共價反應，并得出結論硼酸至少部分是可逆抑制劑。
圖 2通過一系列濃度的蘿卜硫素（A，B，C）和硼酸（D）滅活尿素酶。 測定前，將（A）幽門螺桿菌J99菌株和（B）洋刀豆的尿素酶與滅活劑一起孵育1小時。 分析前，將來自（C）4株幽門螺桿菌（60190、26695，SS1，J99）和洋刀豆（JB）的尿素酶與蘿卜硫素（SF）孵育2小時。 （D）幽門螺桿菌J99菌株的尿素與硼酸（BA）孵育1小時，然后進行測定。 在120（○），100（△），80（▽），60（◇），40（□）和20（+）mM尿素濃度的存在下測量尿素酶活性。
一系列更詳細的研究表明，SF濃度對幽門螺桿菌尿素酶抑制的時間過程是一級反應過程，其速率取決于SF和酶的濃度（圖3）。 此外，滅活的擬一級反應速率常數和滅活劑濃度的雙倒數圖是線性的，這與對另一系統的Kitz和Wilson的分析一致。
圖 3 一系列濃度的蘿卜硫素（SF）使部分純化的幽門螺桿菌尿素酶失活的時間過程。 尿素酶濃度分別為26.7μg/ mL（A）和80μg/ mL（B），在20 mM尿素濃度條件下測量剩余的尿素酶活性。 殘留活性相對于滅活時間的半對數圖是線性的，與一級滅活過程一致。
3.3.蘿卜硫素與尿素酶相互作用的光譜分析
與SF通過共價相互作用使尿素酶失活的建議一致，純化的幽門螺桿菌尿素酶與SF的孵育導致260-320 nm區域紫外線吸收的時間依賴性增加（圖4）。 吸收增加的變化幅度取決于SF的濃度。 圖4B顯示了SF濃度為7.4至740μM的60分鐘后在280 nm處觀察到的吸收差異。 觀察到的吸收變化與SF的異硫氰酸酯（-N = C = S）基團與尿素酶的一個或多個半胱氨酸硫醇基團與在該波長區域吸收更強的二硫代氨基甲酸酯的相互作用相一致。
（A）用740μM蘿卜硫素處理12、30、76和120分鐘的部分純化的幽門螺桿菌尿素酶（9μg/ mL）的差異光譜隨時間變化情況。 對照比色杯中含有同等濃度的蘿卜硫素。 （B）當將蘿卜硫素（7.4 – 740μM）加入部分純化的幽門螺桿菌尿素酶（30μg/ mL）中時，在60分鐘內在280 nm處的吸收變化情況。
尿素酶和尿素酶-SF復合物之間的差異光譜具有兩個吸收最大值（在280 nm和320 nm附近）。 后者與二硫代氨基甲酸酯的形成一致。 差異光譜中的兩個等吸收點（在250和330 nm附近）表明，這些光譜變化的反應涉及到相對特定的化學反應（如圖4A所示）。
3.4. 其他異硫氰酸酯對幽門螺桿菌尿素酶的滅活能力研究
許多SF結構類似物，在濃度為5 mM時，處理幽門螺桿菌尿素酶2小時顯示出廣泛的抑制（滅活）效果（表1）。 因此，盡管天然產物iberin（甲基亞磺酰基丙基-NCS）與SF的具有相同的抑制作用，但甲基硫戊基-NCS、甲基硫代丁基-NCS、甲基亞磺?；粱?NCS和甲基亞磺?；旎?NCS均無活性；從辣木樹中分離的正己基-NCS、芐基-NCS、苯乙基 -NCS、鼠李糖氧基芐基-NCS也都沒有活性。 一個出乎意料的發現是，苯甲?；?ITC（尚未從天然產物中分離出來）的極高滅活效果，它與經臨床測試的尿素酶抑制劑N-（二氨基膦基）-4-氟苯甲酰胺具有實質性的結構相似性。
表1 各種異硫氰酸酯（ITC）使部分純化的幽門螺桿菌尿素酶失活統計表
（ 底物濃度為20 mM尿素，每次測試均使用80μg尿素酶。）
異硫氰酸酯 | 化合物名稱 | 結構 | 濃度 (mM) | 酶活殘留率 (%) | |
30′ | 120′ | ||||
hexyl- | -- | 5 | 100 | 100 | |
5-(methylthio)pentyl-[berteroin] | berteroin | 5 | 100 | 100 | |
4-rhamnopyranosyl-oxy(benzyl)- | -- | 5 | 100 | 100 | |
8-(methylsulfinyl)octyl-[hirsutin] | hirsutin | 5 | -- | 100 | |
5-(methylsulfinyl)pentyl-[alyssin] | alyssin | 5 | -- | 100 | |
2-phenylethyl-[phenethyl] | phenethyl | 5 | -- | 100 | |
benzyl-[tropaeolin] | tropaeolin | 5 | -- | 100 | |
4-(methylthio)butyl-[erucin] | erucin | 5 | 100 | -- | |
3-(methylsulfinyl)propyl-[iberin] | iberin | 5 | 43 | 5 | |
4-(methylsulfinyl)butyl-[sulforaphane] | sulforaphane | 5 | 36 | 0 | |
benzoyl- | -- | 5 | 0 | 0 | |
1 | 12 | -- | |||
0.1 | 77 | -- | |||
0.01 | 100 | -- | |||
3.5. 異硫氰酸酯的殺菌活性與尿素酶抑制活力的關系
先前已報道多種針對幽門螺桿菌菌株的SF最低殺菌濃度（MBC），在每毫升低微克范圍內。 表2顯示了對許多常用的幽門螺桿菌菌株MBC的更詳細的研究結果。這些值相對均勻（2.8-5.6μg/ mL），可與我們之前通過不同方法獲得的測量值相比較（平均值 2-4微克/毫升）。
表2 蘿卜硫素（SF）對幾種幽門螺桿菌的最低殺菌濃度（MBC）
幽門螺桿菌菌種 | 特征 | 最低殺菌濃度MBC (μg/mL) | |
ATCC No. | Common Designation | ||
49503 | 60190 | a cytotoxin-producing strain | 2.8 |
51110 | ure- 60190 variant | near-isogenic urease-minus variant of 60190 | 5.6 |
700824 | J99 | genome-sequenced type-strain; cagA+, vacA+ | 2.8 |
700392 | 26695 | genome-sequenced type-strain | 5.6 |
-- | SS-1 | mouse-adapted human strain | 2.8 |
非常重要的是，SF對尿素酶陰性且因此無感染力的幽門螺桿菌株（ATCC 51110）具有有效的殺菌作用，而有效的尿素酶抑制劑苯甲酰-ITC對我們測試的幾種幽門螺桿菌菌株并沒有殺菌活性（數據未顯示）。 此外，許多ITC誘導的細胞保護酶誘導劑已被證明對幽門螺桿菌具有殺菌作用[例如5-（甲硫基）戊基-ITC（berteroin）、芐基-ITC 8-（甲基亞硫?；┬粱?ITC（hirsutin）、苯乙基-ITC、5-（甲基亞磺?；┪旎?ITC（alyssin）、4-（甲硫基）丁基-ITC（erucin）]， 但它們在與SF、苯甲酰基-ITC和iberin相同的條件下進行測試時，對幽門螺桿菌尿素酶并沒有抑制作用（詳見表1） 。鞣花單寧和三萜TP-225也有類似的研究結果，它們對幽門螺桿菌具有抗生素活性，但對尿素酶沒有抑制作用（數據未顯示）。
有趣的是，與培養的哺乳動物細胞中非常高的SF積累形成鮮明對比的是，幽門螺桿菌并未從培養基中明顯地濃縮SF（數據未顯示）。 顯然，由于SF能殺死有害的（尿素酶陰性或陽性）幽門螺桿菌和缺乏功能性尿素酶的突變幽門螺桿菌菌株，所以SF的殺菌/抑菌作用，主要不是取決于尿素酶的是失活。
尿素酶以假定增加緊密連接通透性的方式直接參與與幽門螺桿菌感染相關的炎癥，并且與酶的催化活性無關。 ITC抑制這種尿素酶作用模式是否可以改變幽門螺桿菌的致病性而不直接殺死或抑制該生物，需要在適當的模型系統中進行闡明。
總之，尿素酶在生物科學史上發揮了不可預見的作用：（i）尿素酶是第一個被結晶的酶（從洋刀豆中結晶），引起JB Sumner將特定的生物活性歸因于純蛋白質，從而掀起了20世紀最激烈的科學辯論之一； （ii）尿素酶是第一個在活性位點需要兩個鎳原子的酶； （iii）尿素酶是由除幽門螺桿菌外的幾種重要的人類感染因子大量合成的，包括奇異變形桿菌，結核分枝桿菌，新隱球菌，并以重要方式引起這些感染的炎癥結果; （iv）已開發出許多用于農業目的的尿素酶抑制劑，以防止土壤因反硝化作用（以及隨后的氨蒸發）而消耗氮。本研究提出了一種可能性，增加異硫氰酸酯類化合物的攝入，可能會減少幽門螺桿菌感染和與之相關的炎癥。異硫氰酸酯的抑制作用，能否在減少全球一半人口幽門螺桿菌感染中發揮重要作用，值得進一步探索。
專題薈萃：本文由福山生物整理翻譯，轉載請注明出處。