潛在抗癌藥物有機硒（NSAIDs-SeCN和SeCF3）衍生物的合成及生物學評價
原文：He X , Zhong M , Li S ,et al.Synthesis and biological evaluation of organoselenium (NSAIDs-SeCN and SeCF3) derivatives as potential anticancer agents[J].European Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 208(12):112864.DOI:10.1016/j.ejmech.2020.112864.
潛在抗癌藥物有機硒（NSAIDs-SeCN和SeCF3）衍生物的合成及生物學評價
摘要：
一系列基于非甾體抗炎藥（NSAIDs）支架和硒功能體（-SeCN和-SeCF3）的有機硒化合物被合成及表征，并對四種癌細胞系SW480（人結腸癌細胞）、HeLa（人宮頸癌細胞）、A549（人肺腺癌細胞），MCF-7（人乳腺腺癌細胞）進行了評估。有趣的是，大多數被研究的化合物在降低不同癌癥細胞系的活性方面表現出活性。活性最強的化合物3h對4種腫瘤細胞株的ic50值均小于20微摩爾，尤其對SW480和MCF-7的ic50值分別為4.9和3.4微摩爾。此外，選擇NSAIDs-SeCN衍生物(2h和2i)和NSAIDs-SeCF3衍生物(3h和3i)，通過調節抗凋亡Bcl-2蛋白、促炎細胞因子(IL-2)和促凋亡caspase-3蛋白的表達，研究其誘導MCF-7細胞凋亡的能力。此外，通過2,2 -二苯基-1-苦基肼(DPPH)、博萊霉素依賴性DNA損傷和類似谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的檢測對合成的候選有機硒的氧化還原性能進行了研究。總之，這些NSAIDs-Se候選藥物可能為進一步潛在的抗癌藥物開發提供有前景的新的先導衍生物。
1.簡介
非甾體抗炎藥（NSAIDs）是一類廣泛應用于臨床治療包括關節炎疼痛在內的多種炎癥性疾病的藥物。另一方面，越來越多的研究探討了非甾體抗炎藥的化學預防作用，如阿司匹林（ASA）和其他非甾體抗炎藥可作為化學預防劑，特別是在結直腸癌（CRC）中。其他研究表明，每天服用ASA可以降低多種癌癥的風險，包括肺癌、乳腺癌、皮膚癌、胰腺癌和卵巢癌。此外，越來越多的研究致力于非甾體抗腫瘤活性，盡管其確切的分子機制仍不清楚。
硒是一種獨特的微量元素，對人類健康和疾病起著至關重要的作用。報道了具有不同官能團的有機硒化合物，包含硒酯、硒氰酸酯、硒酸甲酯、異硒氰酸酯、二烯醚和內環硒等及它們的抗癌活性(圖1)。在這些化合物中，有機硒氰酸鹽在過去二十年中已成為一種很有前途的候選化合物。第一個描述的硒酸鹽是1,4-苯基雙（亞甲基）硒代酸鹽（p-XSC），它被證明對前列腺癌和口腔癌有效細胞。最近, 具有生物活性的有機三氟甲基硫醚（-SCF3）由于其獨特的性質，如高親脂性（Hansch常數p?1.44）、代謝穩定性和電子吸收效應，受到越來越多的關注。與三氟甲基硫化物組相比，三氟甲基硒化物（-SeCF3）組被認為具有更好的親脂性和穩定性。然而，目前有關SeCF3分子生物學性質的文獻報道甚少：近年來，人們特別關注三氟甲基硒化分子的合成方法。
在本報道中，考慮到非甾體抗炎藥的化學預防作用和有機硒化合物的抗癌活性，結合支持硒功能修飾非甾體抗炎藥支架的報道，設計了幾種非甾體抗炎藥SeCN和非甾體抗炎藥SeCF3衍生物，其分子中包含三個基本片段：i）NSAIDs片段；ii）供電子基團；iii）含硒原子的官能團（圖2）。用人癌細胞系SW480（人結腸癌細胞）、HeLa（人宮頸癌細胞）、A549（人肺癌細胞）、MCF-7（人乳腺癌細胞）評價化合物的抗癌活性。此外，通過DPPH、博萊霉素非依賴性DNA損傷和GPx樣分析，研究了化合物的抗氧化能力。最后，將對接研究作為一個初步的預測工具來評估所制備的NSAIDs-Se化合物的可藥性。
2. 結果與討論
2.1 化學
在這里，我們提出了新家族的非甾體抗炎藥硒代物作為潛在的抗癌劑：硒代氰酸鹽，三氟甲基硒化物。
以市售的非甾體抗炎藥和3-硒代溴代丙烷（1）為原料，以EDCI和HOBT為縮合劑，DMF為溶劑，在氮氣氣氛下合成了非甾體抗炎藥SeCN衍生物（2a-2j）（方案1）。
在氮氣氣氛下，以KSeCN為親核供體，在乙腈溶劑中，用-SeCN取代3-溴丙酰胺氫溴酸鹽中的-Br原子，得到化合物1（方案1）。
在四丁基氟化銨（TBAF）存在下，用三甲基（三氟甲基）硅烷（TMSCF3）與相應的硒代氰酸酯衍生物進行反應，得到了三氟甲基硒化物，得到了高收率的3a-3j（收率≥ 85%）（方案1）。
2.2細胞活力測定
方案1中報告的所有受試非甾體抗炎藥Se衍生物均評估其對來自不同人類癌癥類型的人類腫瘤細胞系的抗癌活性：SW480（人結腸癌細胞）、HeLa（人宮頸癌細胞）、A549（人肺癌細胞）、MCF-7（人乳腺癌細胞）。體外抗癌活性的評價采用MTT法，在3個時間點（24h、48h和72h）進行，采用先前發表的NSAIDs-Se雜化化合物（硒代考昔布-1及其谷胱甘肽結合物）的方法，幾乎沒有變化。
如表1所示，所選的非甾體抗炎藥專利（舒林酸、吲哚美辛和酮基布洛芬）即使在最大劑量為50μM的情況下也不會對癌細胞的生存能力產生影響。雜交硒衍生物2a、2d和3e的IC50值表明，在相應的母體非甾體抗炎藥中引入SeCN或SeCF3部分，對腫瘤細胞株有顯著影響。根據這一觀察結果，本研究報告了含硒氰酸鹽和三氟甲基硒化物支架的非甾體抗炎藥硒衍生物的合成及其對表2中使用的相同細胞系的體外抗癌活性。
對表2的匯總和IC50值進行概述分析，結果表明，所有化合物對所有四種癌細胞系均有中等程度的作用，而化合物2a、2e、2h、2i、3a、3b、3d、3e、3g、3h和3i在所有時間點均有效。化合物2h、2i、3h和3i對SW480細胞具有細胞毒性，其IC50值低于10μM。化合物3h和3i對MCF-7細胞具有細胞毒性，IC50值小于5μM。從目前的細胞毒活性實驗來看，所有化合物對特定的腫瘤細胞株似乎都沒有選擇性，有待于進一步擴大腫瘤細胞系的研究范圍，尋找這些化合物的選擇性細胞毒性。
有趣的是，NSAIDs-SeCF3衍生物（3a-3j）的抗癌活性優于相應的NSAIDs-SeCN衍生物（2a-2j），可能是由于親油性的增加，增強了這些NSAIDs-SeCF3衍生物的抗癌活性。在所測化合物中，化合物3h和3i比其它衍生物具有更高的活性。化合物3h對4種腫瘤細胞株均表現出最強的抗腫瘤活性，IC50值在20μM以下，對MCF-7（72h時為2.8μM）和SW480（48h時為3.3μM）具有顯著的抗癌活性。
2.3 MCF-7細胞中Bcl-2、IL-2和caspase-3分子生物標志物的評價。
先前的研究表明，有機硒化合物的潛在死亡機制可能是誘導細胞凋亡。通過檢測各種細胞變化(如細胞形態、細胞周期延遲、caspase 3/7和caspase 8的激活)證實了這一點。
為了探索合成化合物降低細胞活力的機制，我們選擇了最有前途的NSAIDs-Se衍生物2h、2i、3h和3i，通過調節抗凋亡Bcl-2蛋白的表達，研究了它們誘導MCF-7細胞凋亡的能力，促炎細胞因子（IL-2）和促凋亡caspase-3蛋白。
如圖3所示，與未處理的細胞相比，所有化合物均能下調MCF-7細胞中Bcl-2的表達，上調IL-2和Caspase-3的表達。有趣的是，與未處理細胞相比，化合物3h和3i下調了超過50%的Bcl-2表達水平。此外，化合物2h可調節IL-2水平，與未經處理的對照細胞相比，表達量最多增加1.5倍。最后，化合物3i表現出更強的活性，使caspase-3的表達水平比未經處理的細胞提高了5倍。從以上結果來看，化合物2h、2i、3h和3i可能誘導腫瘤細胞凋亡以抑制腫瘤細胞的生長，并符合一些有機硒化合物的潛在機制，這些化合物通過潛在的生物標記物被報道對前列腺癌和口腔癌細胞有效。
2.4抗氧化試驗
活性氧（ROS）是一系列活性氧團簇，存在于所有有氧細胞中。ROS被認為是調節多種生理功能的信號分子過程。各種各樣人類疾病，包括不同類型的癌癥，都與細胞內氧化還原平衡和氧化應激（OS）有關。氧化還原調節劑在潛在的抗腫瘤化療藥物中起著重要作用。
由于在過去幾年中合成了許多有機硒化合物以用作氧化還原調節劑，因此采用不同的生化分析方法，如DPPH、博萊霉素依賴性DNA損傷和Gpx樣分析，進一步評估了所選合成化合物的抗氧化活性。
2.4.1自由基清除能力(DPPH)測定
目前已發展了多種方法來快速預測天然化合物的抗氧化能力，但DPPH化學分析被認為是評價營養產品和有機硒化合物自由基清除活性的快速工具。化合物的抗氧化活性是通過它對DPPH脫色的能力來評估的。自由基(在甲醇中呈紫色)轉化為DPPHH(無色)，并通過517 nm處的吸光度下降來估計自由基的清除活性。采用維生素C作為陽性對照(表3)。
如表3所示，非甾體抗炎藥SeCF3衍生物3h和3i是本試驗中活性最高的化合物，與維生素C相比，具有良好的自由基清除活性。除2d和3d的比較外，NSAIDs-SeCF3衍生物家族在本試驗中優于相應的NSAIDs-SeCN衍生物。
2.4.2博萊霉素DNA損傷試驗
博來霉素（BLM）是一類來自輪狀鏈霉菌的抗腫瘤藥物，被認為能氧化DNA，誘導單鏈和雙鏈斷裂。博來霉素鐵DNA損傷試驗已作為檢測藥物和有機硒化合物潛力的初步方法。如表3所示，化合物2d、3b、3g和3i對DNA降解的誘導作用明顯大于其它受試化合物。
2.4.3谷胱甘肽過氧化物樣活性測定
谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）是一種重要的硒化酶，在人體內被發現，它以內源性巰基谷胱甘肽（GSH）為代價來減少毒性過氧化物。用NADPH還原酶偶聯法測定了所有NSAIDs -Se衍生物的潛在抗氧化活性。合成化合物的GPx活性由NADPH氧化為NADP+引起的吸光度下降（340nm）來估算。以依布硒啉為陽性對照。
如圖4所示，化合物2h、2i、3b、3e、3h和3i表現出比其他衍生物更好的GPx樣活性。化合物3h是本實驗中活性最高的衍生物，是GPx模擬依布硒啉的3倍。
2.5對接研究
基于先前揭示的ethaselen結合模式，研究了對另一種含硒酶硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1) 分別以Cys497和Sec498為硒烯基共價鍵的復合藥性。這里我們采用了非共價對接的方法，因為共價配體的結合方式大多由非共價相互作用決定。
采用柔性對接法將具有良好抗氧化活性的化合物2h，3h，3i連接到大鼠Sec498Cys突變體TrxR1蛋白（PDB id:1H6V）中。硒原子與Cys497或Cys498（0.5nm截止）之間的距離，根據二硫鍵的接近性規則，評估半胱氨酸硫醇攻擊硒化物的可及性。對于每一個被測化合物，產生了多種結合位姿，其中最好的結合位姿是在平衡考慮結合能和與Cys497/Cys498的空間接近性的情況下選出的。
如表4所示，對所有潛在姿勢的總體分析給出了結合親和力和共價反應可能性的評估，表明化合物3h是最有可能的TrxR1抑制劑，平均eCDocker能量最高，硒-半胱氨酸相互作用的可能性更大。與3h相比，化合物2h除了具有相同的骨架外，還具有一個氰基，通過氫鍵直接定向活性硒原子，在大多數情況下，遠離Cys497/Cys498，這說明了平均Se-S Cys498增加的原因距離。對接化合物3i的性能不太令人滿意，可能是由于非甾體抗炎藥核與結合腔的相容性較差。盡管如此，3i在某種程度上是干擾Cys497的最有能力的一個。
對于圖5中的每個頂位，硒原子在羰基氧和鄰近的氫鍵的幫助下，都能容易地接觸到活性Cys497/Cys498殘基(如Ser404)，以及苯環和芳香族殘基的p - p堆積(如Trp 407)。
3.結論
綜上所述，本研究報道了新的有機硒衍生物的合成，包括非甾體抗炎藥支架和硒功能（-SeCN和-SeCF3），化合物3h對MCF-7（72h時為2.8μM）和SW480（48h時為3.3μM）具有顯著的抗癌活性。選擇化合物2h、2i、3h和3i，驗證有機硒化物是否通過調節Bcl-2、IL-2和caspase-3分子標記物的表達，誘導MCF-7細胞凋亡，與未經處理的MCF-7細胞相比，所選化合物能夠下調Bcl-2的表達，上調IL-2和Caspase-3的表達。此外，一些合成的NSAIDs-Se雜化化合物（如2d、2h、2i、3b、3d、3e、3g、3h、3i）在抗氧化性評價中表現出抗氧化活性，包括DPPH、博萊霉素依賴性DNA損傷和Gpx樣檢測。總的來說，考慮到這些非甾體抗炎藥硒衍生物對癌細胞活力、抗氧化活性和對接研究的效力，在一些非甾體抗炎藥中引入硒化物（-SeCN）或三氟甲基硒化物（-SeCF3）部分可以作為進一步設計這種非甾體抗炎藥Se抗癌劑的一個很有前景的出發點。
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